توضیحات

ml	0/5×1	Ser	Control	ml	0/5×1	18	TUP	CAL
ml	6×1	Conj	Enzyme	ml	0/5×1	28	TUP	CAL
ml	6×1	Subs	Chrom	ml	0/5×1	38	TUP	CAL
ml	6×1	Solu	Stop	ml	0/5×1	50	TUP	CAL
ml	25×1	20X	Wash Buf
ºC	8 – 2	48Test	Microplate
T3 Uptake 48 Test

 

---

 

کیت الایزا برای تعیین مقدار برداشت هورمونهای تیروئیدی انسانی

(96 تستی)

T-Up take ELISA Kit

مقدمه :

این کیت برای تعیین کمی میزان برداشت پروتئین های سرم از هورمون های تیروئیدی در سرم انسانی طراحی شده است. هورمون های تیروکسین (T4) و تری یدوتیرونین (T3) عمدتا به پروتئین های خاصی در سرم متصل می شوند، که بعنوان حامل این هورمون ها در جریان خون عمل می کنند. دو پروتئین عمده عبارتند از Thyroxine Binding Globulin (TBG) و آلبومین. درصد بسیار کمی از این هورمون ها بصورت آزاد در جریان خون وجود دارند که این قسمت عامل فعالیت های بیولوژیکی این هورمون ها می باشد. مقدار آزاد هورمون های تیروئیدی نسبت عکس با مقدار متصل شده به پروتئین های سرم دارد. بیماران مبتلا به پرکاری تیروئید غلظت های بالایی از هورمون های تیروئیدی دارند لذا پروتئین های سرم این افراد نسبت به افراد طبیعی اشباع تر می باشند. بالعکس افراد مبتلا به کم کاری تیروئید، غلظت های کمتری از هورمون های تیروئیدی را داشته لذا پروتئین های سرم این افراد نسبت به افراد طبیعی کمتر اشباع می باشد. در برخی حالات پاتولوژیک غلظت پروتئین های سرم افزایش می یابد که در نتیجه آن غلظت تام هورمون های تیروئیدی (بویژه T4) افزایش می یابد، در حالیکه عملکرد تیروئید طبیعی است. لذا تعیین مقدار برداشت هورمون های تیروئیدی (T-Uptake) همراه با تعیین مقدار تام هورمون های تیروئیدی در شرایط خاص نشانگر بهتری برای ارزیابی عملکرد تیروئید می باشد.

 

اساس روش اندازه گیری :

کیت الایزای T-uptake موجود بر اساس سنجش ایمونولوژیکی آنزیمی رقابتی تهیه شده است. چاهک ها توسط آنتی بادی علیه تیروکسین پوشش داده شده اند. در این روش ابتدا استاندارد، سرم کنترل و یا سرم نمونه داخل چاهک ریخته می شود. سپس کونژوگه آنزیمی که محتوی T4 متصل به آنزیم HRP (HRP-T4) و تیروکسین می باشد، به چاهک ها اضافه می شود و مجموعه مخلوط می گردد. تیروکسین موجود در مجموعه برای اتصال به آنتی بادی پوشش داده شده و ظرفیت خالی پروتئین های سرم رقابت می کند. همچنین آنتی بادی پوشش داده شده برای اتصال به کونژوگه آنزیمی و تیروکسین موجود رقابت می کند. پس از زمان انکوباسیون، چاهک ها تخلیه شده و شستشو داده می شوند. سپس به هر چاهک سوبسترای آنزیم اضافه می شود که فعالیت آنزیم بطور معکوس با مقدار برداشت در نمونه ها متناسب است. استانداردهای T-uptake با درصد مشخص، همراه با نمونه های مجهول آزمایش می شوند که بر اساس منحنی استاندارد جذب نور در مقابل درصد برداشت، مقدار برداشت نمونه های مجهول بدست می آید.

 

معرف ها

1- پلیت پوشش داده شده: شامل 96 چاهک جداشدنی که با آنتی بادی منوکلونال موشی ضد T4 پوشش داده شده اند.

2- کونژوگه آنزیمی T-uptake : یک ویال 12 میلی لیتری آماده مصرف محتوی HRP-T4 و تیروکسین.

3- استانداردها : 4 ویال یک میلی لیتری از استاندارد با درصد برداشت 18، 28، 38 و 50 درصد که در سرم نرمال انسانی تهیه شده و از تیومرسال بعنوان نگهدارنده استفاده شده است.

4- سرم کنترل: یک ویال آماده مصرف.

5- محلول شستشو دهنده غلیظ (20X) : یک ویال 25 میلی لیتری محلول شستشو که برای تهیه محلول شستشوی آماده مصرف لازم است این محلول به نسبت 20/1 با آب دیونیزه رقیق شود.

6- محلول رنگ زا: یک ویال 12 میلی لیتری محلول آماده مصرف

7- محلول متوقف کننده واکنش: یک ویال 12 میلی لیتری اسیدسولفوریک یک نرمال.

 

مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نیست

1- سمپلرهای 50 و 100 میکرولیتری دقیق

2- آب دیونیزه

3- دستگاه الایزا ریدر دارای فیلتر 450 نانومتری و در صورت امکان 630 نانومتری بعنوان فیلتر رفرانس.

4- کاغذ جاذب رطوبت

 

نکات قابل توجه برای مصرف کنندگان

1- در این کیت از سرم انسانی استفاده شده است که از نظر HbsAg و HIV منفی بوده اند.

2-از تماس محلول متوقف کننده واکنش (I N H₂SO₄) خودداری کنید. در صورت تماس، با آب فراوان آنرا بشوئید.

3-از استفاده از مواد پس از تاریخ انقضاء خودداری کنید و از مخلوط کردن یا استفاده از کیت ها با شماره بچ مختلف پرهیز نمائید.

4- درب ظروف را پس از استفاده ببندید و از تعویض درب ها جدا خودداری کنید.

5- محلول های محتوی مواد افزودنی یا نگهدارنده مثل سدیم آزاید نباید در واکنش آنزیمی وارد شوند.

 

تهیه و جمع آوری نمونه

1- آزمایش را باید بر روی نمونه های سرمی انجام داد. نمونه های شدیدا همولیزه و دارای چربی باید حذف شوند.

2- نمونه ها را می توان برای دو روز در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد و برای زمان های طولانی تر (تا سی روز) در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری نمود.

3- از انجماد و ذوب مکرر نمونه ها باید خودداری کرد.

 

آماده سازی معرف ها

1- کلیه معرف ها را به دمای اتاق برسانید. قبل از استفاده آنها را به آرامی سر و ته نمایید.

2- برای تهیه محلول شستشوی آماده مصرف، یک حجم از بافر شستشو غلیظ (20X) را با 19 حجم آب دیونیزه رقیق نمائید.

 

روش انجام آزمایش

1- تعداد چاهک های کوت شده برای استانداردها، سرم کنترل و نمونه های بیمار را بصورت 2 تایی انتخاب کنید و مابقی چاهک ها را همراه ماده آبگیر درون کیسه مخصوص قرار داده و درب آنرا ببندید.

2- 50 میکرولیتر از استانداردها، سرم کنترل و نمونه های بیمار را به داخل هر چاهک بریزید.

3- 100 میکرولیتر از کونژوگه آنزیمی T-uptake را به تمام چاهک ها اضافه کنید.

4- پلیت را بمدت 15 ثانیه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهک ها خوب مخلوط شوند. سپس درب چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده، آنرا بمدت یک ساعت در درجه حرارت 37 درجه سانتیگراد و تاریکی انکوبه کنید.

5- محتویات چاهک ها را خالی کرده و چاهک ها را 5 بار با 300 میکرولیتر بافر شستشوی آماده مصرف بشوئید. برای شستشوی چاهک ها، ابتدا 300 میکرولیتر بافر شستشو را داخل چاهک بریزید، سپس چاهک ها را وارونه کرده و همراه با تکان دادن خالی کنید و در انتهای شستشو، با ضربات ملایم بر روی کاغذ جاذب تمامی مایع موجود در چاهک ها را تخلیه نمائید.

6- 100 میکرولیتر از سوبسترای آماده مصرف به تمامی چاهک ها اضافه کنید و آنها را بمدت 20 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی انکوبه نمائید.

7- 100 میکرولیتر از محلول متوقف کننده واکنش به همه چاهک ها اضافه کنید. سپس جذب نور هر چاهک را در طول موج 450 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر قرائت نمائید (در صورت امکان از طول 630 نانومتر بعنوان فیلتر رفرانس استفاده کنید). سنجش جذب نوری باید حداکثر تا 30 دقیقه پس از اتمام آزمایش انجام شود.

 

محاسبه نتایج

1- با استفاده از میانگین جذب نوری استانداردها (محور Y) و درصد برداشت مشخص آنها (محور X) برروی کاغذ میلی متری، منحنی استانداردی رسم کنید.

2- میانگین جذب نوری برای هر نمونه را بدست آورده و روی محور Y جای آنرا پیدا کنید. سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل کنید. از نقطه بدست آمده خطی عمود بر محور X وارد کنید تا نقطه تلاقی که نشان دهنده درصد برداشت غلظت نمونه است، بدست آید.

 

راهنمای محاسبه

مقادیر جذب نوری ارائه شده در جدول ذیل تنها بعنوان راهنمایی آورده شده است و هر آزمایشگاهی باید برای هر بار آزمایش یک منحنی استاندارد جدید بدست آورد.

 

ردیف	مقدار استاندارد(%)	جذب
1	18	2.64
2	28	2.22
3	38	1.40
4	50	0.32

 

مقادیر طبیعی

بدلیل اختلافات سنی، نژادی و رژیم تغذیه، نمی توان برای تمام جمعیت ها محدوده مرجع تعیین کرد. بنابراین هر آزمایشگاه باید محدوده مرجع خود را گزارش نماید. درصد برداشت مقادیر طبیعی در سرم افراد نرمال که توسط آزمایشات مکرر به روش رادیوایمونواسی بدست آمده است به قرار زیر می باشد:

محدوده طبیعی 35 – 25 درصد

خصوصیات کیت

1- دقت

برای محاسبه میزان دقت در یک روز و روزهای مختلف، آزمایش بر روی 3 نمونه سرم 20 بار تکرار شد که ضریب تغییرات به شرح ذیل است.

 

ضریب تغییرات در روز

نمونه سرم	دفعات تکرار	میانگین (%)	انحراف معیار	ضریب تغییرات (%CV)
1	20	22.4	1.60	7.1
2	20	33.1	1.90	5.7
3	20	46.2	2.11	4.6

 

ضریب تغییرات در روزهای مختلف

نمونه سرم	دفعات تکرار	میانگین (%)	انحراف معیار	ضریب تغییرات (%CV)
1	10	20.5	1.80	8.7
2	10	33.0	1.92	5.8
3	10	46.0	2.73	6.0

 

برای دانلود PDF بروشور اینجا کلیک کنید